@MASTERSTHESIS{ 2022:1115027658,
 	title = {Promotores que s?o reconhecidos por diferentes fatores sigma em Escherichia coli},
 	year = {2022},
 	url = "https://tede.ufam.edu.br/handle/tede/8964",
 	abstract = "Introdu??o: Estrat?gias gen?ticas t?m sido utilizadas por d?cadas, melhorando os bioprocessos bacterianos visando a simplifica??o e custo da produ??o de prote?nas recombinantes. Tais estrat?gias incluem o desenho de vetores de express?o eficientes e a melhoria das linhagens bacteriana, neste contexto, os promotores s?o elementos de um vetor de express?o que determinam for?a e dura??o da transcri??o, e consequentemente, o rendimento da prote?na heter?loga a ser produzida. Os promotores bacterianos s?o reconhecidos pelos fatores sigmas, que s?o prote?nas que se acoplam a RNA polimerase para realizar a transcri??o. Os fatores sigmas se ligam aos promotores que respondem a diversas condi??es ambientais que a c?lula enfrenta, dentre eles os mais conhecidos s?o os fatores sigmas 70 e 38, que reconhecem promotores de fase exponencial e estacion?ria da c?lula. Objetivo: Design, clonagem e an?lise de promotores sint?ticos reconhecidos pelos fatores sigmas ?70 e ?38 em Escherichia coli. Material e M?todos: A partir do conhecimento dos elementos consensuais dos promotores, reconhecidos pelos fatores sigma 70 e 38 de Escherichia coli, planejou-se um oligonucleot?deo onde mantinham-se as regi?es consensuais mais importantes dos dois tipos de promotores e foram degeneradas as sequ?ncias de regi?es adjacentes que poderiam influenciar na for?a e especificidade dos promotores. Um oligonucleot?deo parcialmente degenerado de 95 nucleot?deos foi sintetizado por s?ntese qu?mica, amplificado com um par de primers localizados em suas bordas. O amplicon resultante foi digerido com as enzimas de restri??o SpeI e NdeI, purificado por eletroforese em gel de agarose 2%, eluido e clonado entre os s?tios de SpeI e NdeI do plasm?deo pCDM, dessa forma utilizado como um vetor ca?a promotor que cont?m o gene da GFP como rep?rter. As col?nias recombinantes foram escolhidas de acordo com a intensidade de produ??o da GFP, inicialmente a olho nu, posteriormente por fluorimetria para quantificar a produ??o. Os promotores sint?ticos dos clones escolhidos nessa etapa foram sequenciados e analisados. Resultados e Discuss?o: Produziu-se em E. coli, uma biblioteca com 1.741.824 possibilidades de sequ?ncias constru?das por s?ntese qu?mica. A partir de uma clonagem, foram obtidos cerca de 1200 clones recombinantes contendo diferentes promotores, em uma triagem inicial foram escolhidos 66 clones produtores de GFP, e ap?s a confirma??o de conterem promotores sint?ticos foi feita a an?lise da express?o de GFP em meio l?quido. Foram eleitos 16 clones: 5 que expressam baixos n?veis de GFP, 5 n?veis m?dios e 6 altos n?veis; sendo alguns deles capazes de atuar na fase exponencial de crescimento, outros na fase estacion?ria e alguns em ambas as fases. Os novos promotores dos 16 clones escolhidos foram sequenciados e analisados para identificar as regi?es consenso ? 10, -10 estendidas e -35. Analisou-se tamb?m as regi?es n?o consensuais que foram degeneradas, bem como a intensidade de express?o de GFP. Alguns promotores foram modificados no espa?amento entre a posi??o -10 e a -35 e em um dos clones foimodificada a regi?o -35. Os clones J8, J13 e J14 produziram altos n?veis de GFP com mais de 900.000 unidades de fluoresc?ncia, e os clones J1, J2 e J3 foram os que produziram menos GFP de todos os clones analisados. Por essa estrat?gia foi poss?vel obter promotores de diferentes for?as e que se expressam em diferentes fases do crescimento celular, sendo que alguns apresentam n?veis de express?o surpreendentemente altos com poss?veis aplica??es na express?o g?nica para fins industriais.",
 	publisher = {Universidade Federal do Amazonas},
 	scholl = {Programa de P?s-Gradua??o em Biotecnologia},
 	note = {Instituto de Ci?ncias Biol?gicas}
}