@MASTERSTHESIS{ 2017:1474240713,
 	title = {Expressão heteróloga da enteroquinase em enzima Escherichia coli},
 	year = {2017},
 	url = "https://tede.ufam.edu.br/handle/tede/6783",
 	abstract = "A enteroquinase (EC 3.4.21.9) é uma serino protease heterodimérica, ativadora
 natural do tripsinogênio, capaz de clivar especificamente a sequência Asp-Asp-Asp-
 Asp-Lys. Devido à alta especificidade do sítio de reconhecimento tornou-se uma
 ferramenta de grande interesse biotecnológico. É comumente utilizada para a
 remoção in vitro de marcas de afinidade, como etiquetas de fusão (tags) de
 proteínas recombinantes. No presente trabalho, a estratégia de clonagem molecular
 resultou na construção do plasmídeo pDMK06, que é capaz de programar a
 expressão heteróloga regulada do gene ETK-Trx em E.coli. Por meio do processo de
 clivagem com as enzimas de restrição NdeI e BamHI foi possível obter a sequência
 codificadora da proteína de fusão entre enteroquinase e tiorredoxina (ETK-Trx) de
 aproximadamente 1259 pb partir do plasmídeo pENTK, a seguir essa sequência foi
 subclonada nos sítios de NdeI e BamHI do vetor de expressão pDM02, originando o
 plasmídeo recombinante pDMK06. Esse vetor contém o promotor TH2 que é
 regulado eficientemente pelo sistema operador/repressor Lac. Células de
 E.coliJM110 transformadas com o plasmídeo recombinante mostram menor
 crescimento em meio sólido quando a expressão da proteína heteróloga era
 induzida por IPTG em relação ao controle, porém esse efeito não foi detectado em
 meio líquido. Além disto foi analisado por microscopia ótica a morfologia das células
 de E.colicom o plasmídeo recombinante pDMK06, onde observou-se no decorrer do
 tempo de crescimento e indução, alterações na morfologia celular caracterizada de
 filamentação das células induzidas com IPTG quando comparadas com o controle.
 Para análise da expressão da proteína recombinante ETK-Trx utilizou-se a
 eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE das amostras referentes a 8 horas
 de crescimento e indução com IPTG. Os resultados obtidos apresentaram a proteína
 ETK-Trx com tamanho aproximado de 47kDa com alto nível de expressão na fração
 insolúvel, provavelmente em forma de corpúsculo de inclusão. A expressão em altos
 níveis das proteínas ETK-Trx ocorreu de forma perfeitamente regulada mostrando a
 funcionalidade do sistema de expressão/regulação do plasmídeo pDM02.",
 	publisher = {Universidade Federal do Amazonas},
 	scholl = {Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia},
 	note = {Instituto de Ciências Biológicas}
}