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???metadata.dc.type???: Dissertação
Title: Promotores que são reconhecidos por diferentes fatores sigma em Escherichia coli
???metadata.dc.creator???: Maciel, Joyce Belentani de Souza 
???metadata.dc.contributor.advisor1???: Astolfi Filho, Spartaco
???metadata.dc.contributor.referee1???: Mota, Adolfo José da
???metadata.dc.contributor.referee2???: Procópio, Rudi Emerson de Lima
???metadata.dc.description.resumo???: Introdução: Estratégias genéticas têm sido utilizadas por décadas, melhorando os bioprocessos bacterianos visando a simplificação e custo da produção de proteínas recombinantes. Tais estratégias incluem o desenho de vetores de expressão eficientes e a melhoria das linhagens bacteriana, neste contexto, os promotores são elementos de um vetor de expressão que determinam força e duração da transcrição, e consequentemente, o rendimento da proteína heteróloga a ser produzida. Os promotores bacterianos são reconhecidos pelos fatores sigmas, que são proteínas que se acoplam a RNA polimerase para realizar a transcrição. Os fatores sigmas se ligam aos promotores que respondem a diversas condições ambientais que a célula enfrenta, dentre eles os mais conhecidos são os fatores sigmas 70 e 38, que reconhecem promotores de fase exponencial e estacionária da célula. Objetivo: Design, clonagem e análise de promotores sintéticos reconhecidos pelos fatores sigmas σ70 e σ38 em Escherichia coli. Material e Métodos: A partir do conhecimento dos elementos consensuais dos promotores, reconhecidos pelos fatores sigma 70 e 38 de Escherichia coli, planejou-se um oligonucleotídeo onde mantinham-se as regiões consensuais mais importantes dos dois tipos de promotores e foram degeneradas as sequências de regiões adjacentes que poderiam influenciar na força e especificidade dos promotores. Um oligonucleotídeo parcialmente degenerado de 95 nucleotídeos foi sintetizado por síntese química, amplificado com um par de primers localizados em suas bordas. O amplicon resultante foi digerido com as enzimas de restrição SpeI e NdeI, purificado por eletroforese em gel de agarose 2%, eluido e clonado entre os sítios de SpeI e NdeI do plasmídeo pCDM, dessa forma utilizado como um vetor caça promotor que contém o gene da GFP como repórter. As colônias recombinantes foram escolhidas de acordo com a intensidade de produção da GFP, inicialmente a olho nu, posteriormente por fluorimetria para quantificar a produção. Os promotores sintéticos dos clones escolhidos nessa etapa foram sequenciados e analisados. Resultados e Discussão: Produziu-se em E. coli, uma biblioteca com 1.741.824 possibilidades de sequências construídas por síntese química. A partir de uma clonagem, foram obtidos cerca de 1200 clones recombinantes contendo diferentes promotores, em uma triagem inicial foram escolhidos 66 clones produtores de GFP, e após a confirmação de conterem promotores sintéticos foi feita a análise da expressão de GFP em meio líquido. Foram eleitos 16 clones: 5 que expressam baixos níveis de GFP, 5 níveis médios e 6 altos níveis; sendo alguns deles capazes de atuar na fase exponencial de crescimento, outros na fase estacionária e alguns em ambas as fases. Os novos promotores dos 16 clones escolhidos foram sequenciados e analisados para identificar as regiões consenso – 10, -10 estendidas e -35. Analisou-se também as regiões não consensuais que foram degeneradas, bem como a intensidade de expressão de GFP. Alguns promotores foram modificados no espaçamento entre a posição -10 e a -35 e em um dos clones foimodificada a região -35. Os clones J8, J13 e J14 produziram altos níveis de GFP com mais de 900.000 unidades de fluorescência, e os clones J1, J2 e J3 foram os que produziram menos GFP de todos os clones analisados. Por essa estratégia foi possível obter promotores de diferentes forças e que se expressam em diferentes fases do crescimento celular, sendo que alguns apresentam níveis de expressão surpreendentemente altos com possíveis aplicações na expressão gênica para fins industriais.
Abstract: Introduction: Genetic strategies have been used for decades, improving bacterial bioprocesses aimed at simplifying and costing the production of recombinant proteins. Such strategies include the design of efficient expression vectors and the improvement of bacterial strains, in this context, the promoters are elements of an expression vector that determine the strength and duration of the transcription, and consequently, the yield of the hertoiseprotein to be produced. Bacterial promoters are recognized by sigmas factors, which are proteins that engage rna polymerase to perform transcription. Sigma s factors are connected to the promoters that respond to various environmental conditions that the cell faces, among them the best known are the sigmas factors 70 and 38, which recognize exponential and stationary phase promoters of the cell. Goal: Design, cloning and analysis of synthetic promoters recognized by sigmas factors σ70 and σ38 in Escherichia coli. Material and Methods: From the knowledge of the consensual elements of the promoters, recognized by the sigma factors 70 and 38 of Escherichia coli, an oligonucleotide was planned where the most important consensual regions of the two types of promoters were maintained and the sequences of adjacent regions that could influence the strength and specificity of the promoters were degenerated. A partially degenerated oligonucleotide of 95 nucleotides was synthesized by chemical synthesis, amplified with a pair of primers located on its edges. The resulting amplicon was digested with the restriction enzymes SpeI and NdeI, purified by electrophoresis in 2% agarose gel, eluided and cloned between the SpeI and NdeI sites of the pCDM plasmid, thus used as a hunting vector that contains the GFP gene as a reporter. The recombinant colonies were chosen according to the production intensity of PFM, initially with the naked eye, later by fluorimetry to quantify the production. The synthetic promoters of the clones chosen at this stage were sequenced and analyzed. Results and Discussion: A library with 1,741,824 sequence possibilities constructed by chemical synthesis was produced in E. coli. From a cloning, about 1200 recombinant clones containing different promoters were obtained, at an initial screening 66 gfp-producing clones were chosen, and after confirmation of containing synthetic promoters, the expression of PFM was performed in liquid medium. 16 clones were elected: 5 that express low levels of PFM, 5 medium levels and 6 high levels; some of them are capable of acting in the exponential phase of growth, others in the stationary phase and some in both phases. The new promoters of the 16 clones chosen were sequenced and analyzed to identify the consensus regions – 10, -10 extended and -35. We also analyzed the non-consensual regions that were degenerated, as well as the intensity of PFM expression. Some promoters were modified in the spacing between position -10 and -35 and in one of the clones the region -35 was modified. Clones J8, J13 and J14 produced high levels of PFM with more than 900,000 fluorescence units, and clones J1, J2 and J3 produced less PFM of all clones analyzed. Through this strategy it was possible to obtain promoters of different forces and express themselves in different phases of cell growth, and some have surprisingly high levels of expression with possible applications in gene expression for industrial purposes.
Keywords: Escherichia coli
Proteínas recombinantes
???metadata.dc.subject.cnpq???: CIENCIAS BIOLOGICAS: GENETICA
???metadata.dc.subject.user???: Promotores
Fatores sigma
Proteínas recombinantes
Fase estacionária
Language: por
???metadata.dc.publisher.country???: Brasil
Publisher: Universidade Federal do Amazonas
???metadata.dc.publisher.initials???: UFAM
???metadata.dc.publisher.department???: Instituto de Ciências Biológicas
???metadata.dc.publisher.program???: Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia
Citation: MACIEL, Joyce Belentani de Souza. Promotores que são reconhecidos por diferentes fatores sigma em Escherichia coli. 2022. 58 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Universidade Federal do Amazonas, Manaus (AM), 2022.
???metadata.dc.rights???: Acesso Embargado
???metadata.dc.rights.uri???: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/
URI: https://tede.ufam.edu.br/handle/tede/8964
Issue Date: 27-May-2022
Appears in Collections:Mestrado em Biotecnologia

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